Длиннопост для гиков, биологов и тех, кто почему-либо интересуется молекулярно-биологическими подробностями жизни коронавируса и вакцин против него. Некоторое время назад портал для программистов раскопал [1] полную последовательность антикоронавирусной вакцины от Pfizer/BioNTech (она выложена на сайте ВОЗ, можно посмотреть). Ребята написали большой обзор, где попытались объяснить, что все это значит. Он интересен, так как представляет мРНК с программистской точки зрения. С точки зрения биолога в разборе есть некоторое количество несущественных ошибок и нет большого количества интересных вещей – ну просто потому, что для того, чтобы увидеть их в представленной последовательности, нужно быть биологом. Я, разумеется, не могла пройти мимо такой возможности и не разобраться, как же устроена вакцина, которой уже стремительно прививают людей в Европе, США и Израиле. А устроена она, как оказалось, очень хитроумно. Прямо радость берет за человеческий гений. Ниже подробный разбор всего, что напридумывали разработчики, стремясь добиться максимальной эффективности и стабильности вакцины (и, судя по имеющимся предварительным результатам, таки добились).Напомню, вакцина от Pfizer/BioNTech представляет собой мРНК спайк-белка – того самого, при помощи которого коронавирус цепляется за рецепторы ACE2 на человеческих клетках, чтобы затем пролезть в них. Термином мРНК называют особый тип клеточных РНК, который содержит копию последовательности ровно одного гена – в данном случае, гена спайк-белка. Клеточные машины для синтеза белка под названием рибосомы умеют строить белки только на основе информации, которую несут мРНК. То есть смысл вакцины таков: мРНК, несущая последовательность спайк-белка, попадает внутрь клеток, рибосомы синтезируют с нее много спайк-белка, его обнаруживает иммунная система и генерит необходимые антитела и В-клетки памяти, которые сохраняют инструкции по синтезу таких антител. Также на спайк-белок возбуждаются Т-клетки, которые тоже сохраняют воспоминания о нем, чтобы при следующей встрече немедленно активироваться и уничтожить все зараженные клетки.Первое, что бросается в глаза при взгляде на последовательность вакцинной мРНК, – странный значок Ψ (пси). Этой буквой греческого алфавита стандартно обозначают псевдоуридин – особым образом измененный нуклеотид уридин (У). Псевдоуридин – не специально человеческое изобретение, он встречается во многих типах РНК у самых разных организмов: в их геномах, в том числе человеческом, закодированы ферменты для синтеза Ψ. Эксперименты показали, что мРНК, в которых У заменен на Ψ, хуже распознаются иммунной системой. Вероятно, это связано с работой клеточных систем по различению собственных и вирусных РНК: часть У в собственных мРНК после синтеза заменяются на Ψ, а вирусные РНК Ψ не содержат.Теперь, когда мы разобрались с функцией Ψ, самое время сказать, что мРНК-вакцина от Pfizer/BioNTech содержит не его, а метил-псевдоуридин. В некоторых работах было показано, что эта дополнительная модификация улучшает синтез белка с мРНК, которые ее содержат.Помимо замены всех У на Ψ, аминокислоты спайк-белка в вакцинной мРНК от Pfizer/BioNTech закодированы не совсем так, как у вируса. Напомню, каждая аминокислота (базовая структурная единица белка) в геноме кодируется тремя нуклеотидами – кодонами. И так как значащих аминокислот 20, а нуклеотидов четыре, на каждую аминокислоту приходится несколько кодонов. Но обычно каждый вид живых существ предпочитает свои кодоны для разных аминокислот – это означает, что все механизмы систем синтеза белка в клетках такого живого существа заточены распознавать преимущественно эти кодоны.Если в клетку попадает мРНК, несущая непривычные кодоны, синтез белка с нее будет идти медленно или вообще будет невозможен. У коронавируса кодоны, очевидно, заточены под предпочтения летучих мышей, так как именно к их организмам он приспосабливался сотни и тысячи лет. Разработчики вакцины из Pfizer/BioNTech заменили все летучьемышиные кодоны на те, которые привычны ферментным системам клеток человека. Оптимизация или, наоборот, деоптимизация кодонов, – известный трюк. Например, коронавирус в некоторых из живых вакцин от коронавируса ослаблен при помощи обратного приема: в таком вакцинном вирусе привычные организмам людей кодоны заменены на редкие. В результате, заразив клетки человека, такой измененный вирус не может размножиться – но все равно возбуждает ответ иммунной системы.Третье изменение, касающееся последовательности нуклеотидов в вакцинной мРНК, относится к двум кодонам, кодирующим аминокислоты валин и лизин ближе к концу спайк-белка. Они заменены на кодоны, соответствующие аминокислоте пролину. Эта модификация известна как S-2P, и благодаря ей синтезируемый с измененной мРНК спайк-белок оказывается зафиксирован в так называемой открытой конформации (форме) – именно в такой конформации он находится до связывания с клеточными рецепторами ACE2. После связывания спайк-белок меняет форму на закрытую и разрезается клеточными протеазами на две части.Фишка в том, что спайк принимает открытую и закрытую конформации самопроизвольно – это термодинамический процесс. Но связаться с рецептором может только открытая конформация, поэтому именно ее нужно блокировать антителами, чтобы предотвратить заражение. Вакцинные спайк-белки, несущие модификацию S-2P, всегда находятся в открытой конформации, поэтому провоцируют появление только максимально эффективных антител. Обычный спайк провоцирует наработку антител и против закрытой конформации, которые заражение не предотвращают.Еще несколько модификаций касаются так называемых 3’-UTR и 5’-UTR-участков. UTR – сокращение от untranslated region, что означает «нетранслируемый участок». Трансляция – это процесс синтеза белка, и, как следует из названия, с последовательностей 3’-UTR и 5’-UTR белок не синтезируется. Тем не менее, они чрезвычайно важны, потому что в них содержится масса указаний для всевозможных ферментных систем клетки относительно того, что и как делать с этой конкретной мРНК. В числе прочего, 3’-UTR и 5’-UTR несут инструкции, как долго клеточные машины-разрушители могут игнорировать мРНК (на самом деле, эти сигналы работают несколько сложнее, но сейчас это неважно).Причем в зависимости от ситуации ген одного и того же белка может копироваться в последовательность мРНК с разными инструкциями – потому что, например, в одних клетках этот белок должен синтезироваться долго, а в других – только некоторое время. Некоторые мРНК и вовсе нужно уничтожить как можно быстрее, потому что гены, чью последовательность они несут, кодируют белки, действие которых должно длиться совсем чуть-чуть – например, гены цитокинов. Эти белки призваны позвать на помощь иммунные клетки к месту битвы с врагом, где наблюдается перевес сил противника, и, наверно, за год ковида все уже выучили, что, если цитокины работают слишком долго, это приводит к катастрофическим последствиям. Но, в любом случае, клетки не любят, когда в них скапливается много лишнего, поэтому все отработавшие структуры должны быть уничтожены в особых компартментах – и сигналы, которые необходимы для транспорта отживших свое структур туда, тоже находятся в нетранслируемых участках.Контринтуитивно, 5’-UTR находится перед последовательностью, несущей собственно ген, а 3’-UTR идет сразу за ней. Главные инструкции, касающиеся времени жизни мРНК, находятся в 3’-UTR, то есть в хвосте мРНК. В последовательности 3’-UTR мРНК от Pfizer/BioNTech нет так называемых AU-богатых участков (то есть участков, состоящих преимущественно из нуклеотидов А и У или Ψ), которые служат сигналом для ферментов-разрушителей. Разработчики присоединили к мРНК спайк-белка 3’-UTR без таких сигналов, чем значительно увеличили ее стабильность. Кроме того, в 3’-UTR дополнительно внесены две последовательности, которые существенно – примерно вдвое – продлевают время жизни мРНК в цитоплазме по сравнению со средней клеточной мРНК. Эти последовательности скопированы из генов белков, которые должны работать в клетке долго. Ученые, занимающиеся разработкой технологии терапевтических мРНК (а это далеко не только антиковидные вакцины), специально искали такие продлевающие жизнь мРНК последовательности, долго и нудно проводя скрининг всех клеточных мРНК.Над 5’-концом вакцинной мРНК разработчики из Pfizer/BioNTech тоже поработали. Именно с этого конца рибосома начинает синтезировать белок, считывая информацию, закодированную в мРНК. 5’-UTR не только служит физическим местом посадки рибосомы, но, точно так же, как 3’-UTR, несет дополнительные инструкции, как именно нужно считывать эту мРНК. 5’-UTR участок вакцины от Pfizer/BioNTech содержит инструкции, скопированные с 5’-UTR участка мРНК белков альфа-глобинов, работающих в эритроцитах – красных кровяных клетках. У эритроцитов нет ядра, поэтому пополнить запас мРНК неоткуда. При этом, в среднем, каждая красная клетка крови живет около четырех месяцев, и все это время в ней синтезируются необходимые белки. Многодневная стабильность нужных мРНК и непрерывный синтез белков с нее обеспечивается особыми последовательностями в 5’-UTR участке, которые и заимствовали создатели вакцины.Еще пара модификаций по мелочи. К 5’-концу мРНК присоединена особая химическая структура под названием кэп (от английского cap, то есть кепка или шапка). мРНК без кэпа немедленно распознаются клеточными стражниками как вирусные и уничтожаются. Кроме того, «правильный» кэп способен существенно повысить эффективность трансляции, то есть синтеза белка. Работая над терапевтическими мРНК, ученые пробовали разные варианты кэпов, и тот, что использовали создатели вакцины от Pfizer/BioNTech, дает один из самых высоких уровней трансляции.После кэпа и 5’-UTR находится так называемая последовательность сигнального пептида, она же лидерная последовательность, которая определяет, куда должен отправиться синтезированный с этой мРНК белок. В данном случае это место – эндоплазматический ретикулум (ЭР), где на белки навешиваются всякие нужные довески (собственно, все белки в ЭР и синтезируются, но потом они могут отправиться в разные места). Последовательность настоящего вирусного спайк-белка тоже содержит лидерную последовательность, определяющая, что его необходимо оставить в эндоплазматическом ретикулуме. Там на спайк-белок навешиваются цепочки из сахара под названием манноза, потому что вообще-то спайк-белок – вовсе не белок, а гликопротеин, то есть белок с привинченными к нему сахарными остатками (которые, на минуточку, закрывают от иммунной системы значительную часть поверхности спайка, мешая производить антитела к ней). Воспроизвести нативную конформацию и все химические модификации крайне важно, потому что при встрече с реальным вирусом иммунная система увидит именно такой спайк. Если спайк-белок из вакцины не будет похож на настоящий, то, тренируясь на нем, иммунная система научится производить антитела, которые будут плохо распознавать реальный спайк, а это не то, что нам надо.Еще одна особенность, также продлевающая время жизни мРНК в цитоплазме – длинный поли(А)-хвост. Этим термином называют последовательность нуклеотидов под названием аденозин (монофосфат), которой заканчивается любая мРНК. Поли(А)-хвост выполняет много разных функций, например, помогает рибосоме слезть с мРНК, когда трансляция закончена. Кроме того, на длинную цепь аденозинов садятся многие белки – скажем, те, которые перетаскивают мРНК из ядра, где она синтезируется, в цитоплазму, где находится ее место работы, или белки, защищающие мРНК от разрушения. Со временем поли(А)-хвост укорачивается, защитные белки перестают помещаться на нем – и такие куцые мРНК узнаются белками-разрушителями. Поэтому чем длиннее цепочка аденозинов на конце мРНК, тем дольше она будет жить в цитоплазме. У вакцины от Pfizer/BioNTech поли(А)-хвост состоит из 110 аденозинов – это много.Как видно, мРНК-вакцина – не просто скопированная в РНК последовательность гена спайк-белка, а сложный биотехнологический продукт, результат долгих лет исследований, плотно нашпигованный разными хитрыми молекулярно-биологическими ухищрениями (и это мы еще не обсуждали липидные нанокапсулы, внутри которых мРНК-вакцина попадает в организм, там тоже много всего). Из всех имеющихся вариантов этот больше всего похож на вакцину будущего.Тем удивительнее, что простые в исполнении и незамысловатые по идее векторные вакцины (чего там: взяли ген спайк-белка и заклонировали в аденовирусный вектор, задача для курсовой работы студента-четверокурсника биофака – хотя у AstraZeneca в гене спайка таки оптимизированы кодоны), вроде бы, демонстрируют сравнимую эффективность – впрочем, во-первых, пока у нас есть данные только по краткосрочной перспективе и мы пока не понимаем, насколько значим будет неизбежно возникающий аутоиммунитет к вектору, а во-вторых, испытания обеих публичных векторных вакцин – «Спутник V» и «оксфордской вакцины» от AstraZeneca, – по сути, провалились (на всякий случай, поясню, что "испытания провалились" не равно "вакцина плохая", в данном случае это означает, что нужны дополнительные испытания). Так что, как говорится, будем посмотреть.