Irina Yakutenko

Irina Yakutenko про коронавирус

Все посты

https://facebook.com/irina.yakutenko
Вирус
•
05-01-2021 23:26:50
Длиннопост для гиков, биологов и тех, кто почему-либо интересуется молекулярно-биологическими подробностями жизни коронавируса и вакцин против него. Некоторое время назад портал для программистов раскопал [1] полную последовательность антикоронавирусной вакцины от Pfizer/BioNTech (она выложена на сайте ВОЗ, можно посмотреть). Ребята написали большой обзор, где попытались объяснить, что все это значит. Он интересен, так как представляет мРНК с программистской точки зрения. С точки зрения биолога в разборе есть некоторое количество несущественных ошибок и нет большого количества интересных вещей – ну просто потому, что для того, чтобы увидеть их в представленной последовательности, нужно быть биологом. Я, разумеется, не могла пройти мимо такой возможности и не разобраться, как же устроена вакцина, которой уже стремительно прививают людей в Европе, США и Израиле. А устроена она, как оказалось, очень хитроумно. Прямо радость берет за человеческий гений. Ниже подробный разбор всего, что напридумывали разработчики, стремясь добиться максимальной эффективности и стабильности вакцины (и, судя по имеющимся предварительным результатам, таки добились).Напомню, вакцина от Pfizer/BioNTech представляет собой мРНК спайк-белка – того самого, при помощи которого коронавирус цепляется за рецепторы ACE2 на человеческих клетках, чтобы затем пролезть в них. Термином мРНК называют особый тип клеточных РНК, который содержит копию последовательности ровно одного гена – в данном случае, гена спайк-белка. Клеточные машины для синтеза белка под названием рибосомы умеют строить белки только на основе информации, которую несут мРНК. То есть смысл вакцины таков: мРНК, несущая последовательность спайк-белка, попадает внутрь клеток, рибосомы синтезируют с нее много спайк-белка, его обнаруживает иммунная система и генерит необходимые антитела и В-клетки памяти, которые сохраняют инструкции по синтезу таких антител. Также на спайк-белок возбуждаются Т-клетки, которые тоже сохраняют воспоминания о нем, чтобы при следующей встрече немедленно активироваться и уничтожить все зараженные клетки.Первое, что бросается в глаза при взгляде на последовательность вакцинной мРНК, – странный значок Ψ (пси). Этой буквой греческого алфавита стандартно обозначают псевдоуридин – особым образом измененный нуклеотид уридин (У). Псевдоуридин – не специально человеческое изобретение, он встречается во многих типах РНК у самых разных организмов: в их геномах, в том числе человеческом, закодированы ферменты для синтеза Ψ. Эксперименты показали, что мРНК, в которых У заменен на Ψ, хуже распознаются иммунной системой. Вероятно, это связано с работой клеточных систем по различению собственных и вирусных РНК: часть У в собственных мРНК после синтеза заменяются на Ψ, а вирусные РНК Ψ не содержат.Теперь, когда мы разобрались с функцией Ψ, самое время сказать, что мРНК-вакцина от Pfizer/BioNTech содержит не его, а метил-псевдоуридин. В некоторых работах было показано, что эта дополнительная модификация улучшает синтез белка с мРНК, которые ее содержат.Помимо замены всех У на Ψ, аминокислоты спайк-белка в вакцинной мРНК от Pfizer/BioNTech закодированы не совсем так, как у вируса. Напомню, каждая аминокислота (базовая структурная единица белка) в геноме кодируется тремя нуклеотидами – кодонами. И так как значащих аминокислот 20, а нуклеотидов четыре, на каждую аминокислоту приходится несколько кодонов. Но обычно каждый вид живых существ предпочитает свои кодоны для разных аминокислот – это означает, что все механизмы систем синтеза белка в клетках такого живого существа заточены распознавать преимущественно эти кодоны.Если в клетку попадает мРНК, несущая непривычные кодоны, синтез белка с нее будет идти медленно или вообще будет невозможен. У коронавируса кодоны, очевидно, заточены под предпочтения летучих мышей, так как именно к их организмам он приспосабливался сотни и тысячи лет. Разработчики вакцины из Pfizer/BioNTech заменили все летучьемышиные кодоны на те, которые привычны ферментным системам клеток человека. Оптимизация или, наоборот, деоптимизация кодонов, – известный трюк. Например, коронавирус в некоторых из живых вакцин от коронавируса ослаблен при помощи обратного приема: в таком вакцинном вирусе привычные организмам людей кодоны заменены на редкие. В результате, заразив клетки человека, такой измененный вирус не может размножиться – но все равно возбуждает ответ иммунной системы.Третье изменение, касающееся последовательности нуклеотидов в вакцинной мРНК, относится к двум кодонам, кодирующим аминокислоты валин и лизин ближе к концу спайк-белка. Они заменены на кодоны, соответствующие аминокислоте пролину. Эта модификация известна как S-2P, и благодаря ей синтезируемый с измененной мРНК спайк-белок оказывается зафиксирован в так называемой открытой конформации (форме) – именно в такой конформации он находится до связывания с клеточными рецепторами ACE2. После связывания спайк-белок меняет форму на закрытую и разрезается клеточными протеазами на две части.Фишка в том, что спайк принимает открытую и закрытую конформации самопроизвольно – это термодинамический процесс. Но связаться с рецептором может только открытая конформация, поэтому именно ее нужно блокировать антителами, чтобы предотвратить заражение. Вакцинные спайк-белки, несущие модификацию S-2P, всегда находятся в открытой конформации, поэтому провоцируют появление только максимально эффективных антител. Обычный спайк провоцирует наработку антител и против закрытой конформации, которые заражение не предотвращают.Еще несколько модификаций касаются так называемых 3’-UTR и 5’-UTR-участков. UTR – сокращение от untranslated region, что означает «нетранслируемый участок». Трансляция – это процесс синтеза белка, и, как следует из названия, с последовательностей 3’-UTR и 5’-UTR белок не синтезируется. Тем не менее, они чрезвычайно важны, потому что в них содержится масса указаний для всевозможных ферментных систем клетки относительно того, что и как делать с этой конкретной мРНК. В числе прочего, 3’-UTR и 5’-UTR несут инструкции, как долго клеточные машины-разрушители могут игнорировать мРНК (на самом деле, эти сигналы работают несколько сложнее, но сейчас это неважно).Причем в зависимости от ситуации ген одного и того же белка может копироваться в последовательность мРНК с разными инструкциями – потому что, например, в одних клетках этот белок должен синтезироваться долго, а в других – только некоторое время. Некоторые мРНК и вовсе нужно уничтожить как можно быстрее, потому что гены, чью последовательность они несут, кодируют белки, действие которых должно длиться совсем чуть-чуть – например, гены цитокинов. Эти белки призваны позвать на помощь иммунные клетки к месту битвы с врагом, где наблюдается перевес сил противника, и, наверно, за год ковида все уже выучили, что, если цитокины работают слишком долго, это приводит к катастрофическим последствиям. Но, в любом случае, клетки не любят, когда в них скапливается много лишнего, поэтому все отработавшие структуры должны быть уничтожены в особых компартментах – и сигналы, которые необходимы для транспорта отживших свое структур туда, тоже находятся в нетранслируемых участках.Контринтуитивно, 5’-UTR находится перед последовательностью, несущей собственно ген, а 3’-UTR идет сразу за ней. Главные инструкции, касающиеся времени жизни мРНК, находятся в 3’-UTR, то есть в хвосте мРНК. В последовательности 3’-UTR мРНК от Pfizer/BioNTech нет так называемых AU-богатых участков (то есть участков, состоящих преимущественно из нуклеотидов А и У или Ψ), которые служат сигналом для ферментов-разрушителей. Разработчики присоединили к мРНК спайк-белка 3’-UTR без таких сигналов, чем значительно увеличили ее стабильность. Кроме того, в 3’-UTR дополнительно внесены две последовательности, которые существенно – примерно вдвое – продлевают время жизни мРНК в цитоплазме по сравнению со средней клеточной мРНК. Эти последовательности скопированы из генов белков, которые должны работать в клетке долго. Ученые, занимающиеся разработкой технологии терапевтических мРНК (а это далеко не только антиковидные вакцины), специально искали такие продлевающие жизнь мРНК последовательности, долго и нудно проводя скрининг всех клеточных мРНК.Над 5’-концом вакцинной мРНК разработчики из Pfizer/BioNTech тоже поработали. Именно с этого конца рибосома начинает синтезировать белок, считывая информацию, закодированную в мРНК. 5’-UTR не только служит физическим местом посадки рибосомы, но, точно так же, как 3’-UTR, несет дополнительные инструкции, как именно нужно считывать эту мРНК. 5’-UTR участок вакцины от Pfizer/BioNTech содержит инструкции, скопированные с 5’-UTR участка мРНК белков альфа-глобинов, работающих в эритроцитах – красных кровяных клетках. У эритроцитов нет ядра, поэтому пополнить запас мРНК неоткуда. При этом, в среднем, каждая красная клетка крови живет около четырех месяцев, и все это время в ней синтезируются необходимые белки. Многодневная стабильность нужных мРНК и непрерывный синтез белков с нее обеспечивается особыми последовательностями в 5’-UTR участке, которые и заимствовали создатели вакцины.Еще пара модификаций по мелочи. К 5’-концу мРНК присоединена особая химическая структура под названием кэп (от английского cap, то есть кепка или шапка). мРНК без кэпа немедленно распознаются клеточными стражниками как вирусные и уничтожаются. Кроме того, «правильный» кэп способен существенно повысить эффективность трансляции, то есть синтеза белка. Работая над терапевтическими мРНК, ученые пробовали разные варианты кэпов, и тот, что использовали создатели вакцины от Pfizer/BioNTech, дает один из самых высоких уровней трансляции.После кэпа и 5’-UTR находится так называемая последовательность сигнального пептида, она же лидерная последовательность, которая определяет, куда должен отправиться синтезированный с этой мРНК белок. В данном случае это место – эндоплазматический ретикулум (ЭР), где на белки навешиваются всякие нужные довески (собственно, все белки в ЭР и синтезируются, но потом они могут отправиться в разные места). Последовательность настоящего вирусного спайк-белка тоже содержит лидерную последовательность, определяющая, что его необходимо оставить в эндоплазматическом ретикулуме. Там на спайк-белок навешиваются цепочки из сахара под названием манноза, потому что вообще-то спайк-белок – вовсе не белок, а гликопротеин, то есть белок с привинченными к нему сахарными остатками (которые, на минуточку, закрывают от иммунной системы значительную часть поверхности спайка, мешая производить антитела к ней). Воспроизвести нативную конформацию и все химические модификации крайне важно, потому что при встрече с реальным вирусом иммунная система увидит именно такой спайк. Если спайк-белок из вакцины не будет похож на настоящий, то, тренируясь на нем, иммунная система научится производить антитела, которые будут плохо распознавать реальный спайк, а это не то, что нам надо.Еще одна особенность, также продлевающая время жизни мРНК в цитоплазме – длинный поли(А)-хвост. Этим термином называют последовательность нуклеотидов под названием аденозин (монофосфат), которой заканчивается любая мРНК. Поли(А)-хвост выполняет много разных функций, например, помогает рибосоме слезть с мРНК, когда трансляция закончена. Кроме того, на длинную цепь аденозинов садятся многие белки – скажем, те, которые перетаскивают мРНК из ядра, где она синтезируется, в цитоплазму, где находится ее место работы, или белки, защищающие мРНК от разрушения. Со временем поли(А)-хвост укорачивается, защитные белки перестают помещаться на нем – и такие куцые мРНК узнаются белками-разрушителями. Поэтому чем длиннее цепочка аденозинов на конце мРНК, тем дольше она будет жить в цитоплазме. У вакцины от Pfizer/BioNTech поли(А)-хвост состоит из 110 аденозинов – это много.Как видно, мРНК-вакцина – не просто скопированная в РНК последовательность гена спайк-белка, а сложный биотехнологический продукт, результат долгих лет исследований, плотно нашпигованный разными хитрыми молекулярно-биологическими ухищрениями (и это мы еще не обсуждали липидные нанокапсулы, внутри которых мРНК-вакцина попадает в организм, там тоже много всего). Из всех имеющихся вариантов этот больше всего похож на вакцину будущего.Тем удивительнее, что простые в исполнении и незамысловатые по идее векторные вакцины (чего там: взяли ген спайк-белка и заклонировали в аденовирусный вектор, задача для курсовой работы студента-четверокурсника биофака – хотя у AstraZeneca в гене спайка таки оптимизированы кодоны), вроде бы, демонстрируют сравнимую эффективность – впрочем, во-первых, пока у нас есть данные только по краткосрочной перспективе и мы пока не понимаем, насколько значим будет неизбежно возникающий аутоиммунитет к вектору, а во-вторых, испытания обеих публичных векторных вакцин – «Спутник V» и «оксфордской вакцины» от AstraZeneca, – по сути, провалились (на всякий случай, поясню, что "испытания провалились" не равно "вакцина плохая", в данном случае это означает, что нужны дополнительные испытания). Так что, как говорится, будем посмотреть.
Источник: https://www.facebook.com/irina.yakutenko/posts/10158828440654800
472
ИВЛ
•
24-12-2020 05:56:02
Мой текст про то, что немецкие медики узнали – и подробно описали в одном из самых крутых научных медицинских журналов The Lancet – об отравлении Навального, вышел на The Insider [1]. Кстати, сама эта статья написана по запросу журнала [2]. Здесь публикую тоже почти целиком. Авторы статьи рассказали нам много интересного – как прямо, так и между строк.Уже в первом абзаце мы узнаем, что омские врачи не сообщили немецким, чем же лечили Навального в первые часы после приземления. «Терапевтические меры включали интубацию, ИВЛ и неуточненные препараты для купирования симптомов и нейропротекции», – написано в статье. Это несколько противоречит уверениям, что немцам передали все-все сведения, относящиеся к лечению.В том же первом абзаце авторы перечисляют исходные симптомы Навального, указанные в выписке, которую выдали омские врачи. В числе прочего там повышенная потливость и повышенное слюноотделение – запомните эти скучные медицинские термины, они нам потребуются дальше. Заключение омских медиков: дыхательная недостаточность, миоклонические судороги, нарушение углеводного обмена (да-да) и обмена электролитов и вызванная метаболическими расстройствами энцефалопатия, то есть поражение головного мозга.Из следующего раздела статьи «Течение болезни» мы узнаем точное время, которое прошло от момента, когда Навальный начал кричать в самолете, до момента, когда его начали изучать врачи «Шарите» – 55 часов. В немецкий медицинский самолет он попал спустя 47 часов после начала симптомов, но там ему не проводили никаких специальных мероприятий, а вводили только препараты для седации – всех пациентов на ИВЛ седируют – и солевые растворы для восстановления объема жидкости, грубо говоря, физраствор. В «Шарите» Навальный прибыл в коме, с редким сердцебиением, температурой 33,5°C, повышенной потливостью, повышенным слюноотделением, суженными зрачками, которые не реагировали на свет, признаками поражения мозга – у него были снижены одни типы рефлексов и повышены другие. Анализ крови показал, что у него повышено содержание некоторых ферментов, в том числе амилазы и липазы.Все это – типичные признаки отравления органофосфатами (именно к этой группе принадлежит новичок), веществами, блокирующими ферменты под названием холинэстеразы. Эти симптомы прописаны во всех учебниках, и с ними должны быть знакомы все врачи, а не только суперпрофи из «Шарите» – не потому что все врачи должны уметь лечить отравления боевыми химическими веществами, а потому что к той же группе относятся многие пестициды, широко используемые в сельском хозяйстве. «Решение о применении тех или иных клинических мероприятий <при отравлении органофосфатами> преимущественно основано на опыте отравлений пестицидами, которые по-прежнему являются серьезной проблемой в юго-восточной Азии, где от таких отравлений ежегодно умирает 100 тысяч человек. Диагностирование отравления органофосфатами не должно вызывать никаких проблем», – пишут авторы статьи в The Lancet. Но, как мы помним, в выписке из омской больницы стояло «нарушение обмена веществ». Соображения по поводу того, как такое возможно, не могут быть опубликованы в научном журнале по соображениям академической этики.Врачи из «Шарите» диагноз поставили сразу и немедленно начали вводить Навальному атропин и обидоксим. Атропин, который все знают по посещению офтальмолога, связывается с холинорецепторами (подробнее о них чуть ниже) на различных органах. Само по себе это не очень хорошо – вспомните расширенные зрачки после того, как атропин закапают в глаза – а при больших дозах атропином можно и отравиться. Все иначе, когда в организме присутствует ингибитор (блокатор) холинэстераз. Эти ферменты в норме расщепляют нейромедиатор ацетилхолин – очень важную молекулу, которая, в числе прочего, передает приказы мозга мышцам и постоянно синтезируется в организме. Когда этот фермент не работает, в организме скапливается огромное количество ацетилхолина, который делает то, что ему положено – садится на свои рецепторы (в том числе, те самые холинорецепторы) в разных органах и передает приказы, которые уже давно неактуальны. Фактически, это такая DDos атака на организм, и, если она длится долго, то легко может убить его. Атропин физически занимает рецепторы ацетилхолина, не давая нейромедиатору соединиться с ними.Это первая помощь при отравлениях органофосфатами – и, судя по тому, что написано в The Lancet, атропин Навальному в Омске введен был, хотя в выписке об этом не сообщалось. Знаем мы это потому, что немецкие врачи немедленно взяли у Навального анализы всевозможных биологических жидкостей и обнаружили там следы разных лекарств, в том числе атропина. Остальные лекарства, которые нашли немцы, – это препараты, необходимые для поддержания медицинской комы и антибактериальный препарат левофлоксацин, который используют, в том числе, для лечения инфекции мочеполовых путей (ИМП), например, у пациентов, которым ставят мочевой катетер. При коме он, как вы понимаете, стоит, и левофлоксацин могли использовать как профилактику ИМП и инфекций других органов. Как мы увидим дальше, он не помог, но пока вернемся к ингибиторам холинэстераз.Положительный эффект атропина врачи увидели уже через час после начала терапии – а вот второй препарат – обидоксим – эффекта не дал. Медики узнали об этом не сами: сообщение, что препарат не действует, пришло из специализированной токсикологической лаборатории бундесвера, где провели тесты с кровью Навального. Обидоксим связывается с ацетилхолинэстеразой (АХЭ – главная холинэстераза организма, работа которой имеет критическое значение) и удаляет с нее химическую группу, которая навешивается при контакте с фосфорорганическими соединениями (ФОС). Но это работает только для «мирных» органофосфатов, которые используются в качестве лекарств. Многие пестициды и боевые ФОСы выводят из строя ацетилхолинэстеразу необратимо. Тесты все в той же лаборатории бундесвера показали, что свободных ингибиторов АХЭ – то есть собственно отравляющих веществ – в крови нет.Все это указывает, что в организм Навального попало не лекарство – ингибиторы АХЭ используются при лечении, например, болезни Альцгемейра или глаукомы, а нечто более серьезное. Прямо об этом в статье не написано, но никакого иного вывода из данных о неэффективности обидоксима и обратимых ингибиторов ФОС сделать невозможно. Это, так сказать, вывод, записанный между строк.Еще одно неявное сообщение статьи в The Lancet – этого неизвестного ФОС в организме Навального было много. Такое заключение следует из данных об активности бутирилхолинэстеразы (БХЭ) – второго типа холинэстераз нашего организма, функции которой не до конца ясны, но блокируется ФОСами она точно так же, как основная ацетилхолинэстераза и ее много в плазме крови, что облегчает анализ. То есть врачи анализируют состояние БХЭ, и оно отражает ситуацию с главной холинэстеразой. Так вот, при поступлении Навального в «Шарите» активность БХЭ равнялась нулю. Через четыре дня терапии атропином она немного выросла, но затем остановилась на уровне, который меньше, чем тот, что нужен для нормальной работы организма. В результате медики перелили Навальному донорскую плазму крови. После этого активность БХЭ выросла и уже не уменьшалась – что заодно указало на то, что самого яда в организме уже не было. Кстати, тесты на активность БХЭ – еще один стандартный прием, который используется для подтверждения диагноза «отравление ФОС». «Такие тесты используются для оценки работы печеночных ферментов, широко применяются в клинической практике и обычно являются единственным лабораторным параметром, необходимым для того, чтобы подтвердить отравление ФОС», – пишут авторы в статье в The Lancet. Еще одно скрытое послание по поводу диагностики состояния Навального.Ну и последний занятный момент – так сказать, милая деталь. На четвертый день пребывания в «Шарите» у Навального поднялась высокая температура и резко выросли маркеры, указывающие на системное воспаление. Мазки с кожи, взятые при поступлении, показали целый зоопарк разных бактерий, устойчивых ко всем распространенным антибиотикам – это так называемые внутрибольничные, или госпитальные штаммы. Они размножаются в больницах, где врачи используют множество антибактериальных препаратов, и, пытаясь выжить, вырабатывают устойчивость к ним. Большинство заведшихся в больницах бактерий погибают, но те, которые проходят этот отбор, становятся абсолютно неубиваемыми. Это очень большая – и, что хуже, быстро увеличивающаяся – проблема. Госпитальные инфекции ежегодно уносят жизни десятков тысяч людей, против этих микробов помогают (да и то не всегда) только антибиотики запаса, которые часто весьма токсичны.Опасаясь, что обнаруженные у Навального устойчивые стафилококки могут вызвать системную инфекцию, ему вводили один из таких запасных – то есть не используемых в широкой практике – антибиотиков под названием ванкомицин. Для лечения инфекции мочеполовых путей – от которой, очевидно, не спас используемый в Омске левофлоксацин, так как размножившиеся там бактерии были к нему устойчивы – немецкие медики применяли антибактериальный препарат, к которому, как оказалось, вызвавшие инфекцию бактерии устойчивы не были. Кроме того, Навальному делали ингаляции с колистином – еще одним токсичным антибиотиком запаса (он крайне вреден для почек). Причина – гнойная жидкость в легких и повышенный уровень С-реактивного белка, одного из маркеров воспаления. Другими словами, немцы предполагали, что какая-то из суперустойчивых бактерий оккупировала легкие. «По счастью, несмотря на высокий риск аспирации (попадания рвотных масс, еды или жидкости в дыхательные пути) в бессознательном состоянии вскоре после начала симптомов и колонизацию несколькими разновидностями устойчивых к антибиотикам бактерий, у пациента не развилась тяжелая инфекция. Вероятно, выздоровлению во многом поспособствовало хорошее состояние здоровья пациента до инфекции», – заканчивают свою статью немецкие врачи.
Источник: https://www.facebook.com/irina.yakutenko/posts/10158798836709800
809